生物學研究中的LED：

從顯微成像到光遺傳學

由于LED被引入生物科學研究的顯微鏡照明，使研究小組和影像實驗室有信心將其范圍和潛力完全取代金屬鹵化物光源涮瞻，合適的HBO弧光燈替代品一直是一個挑戰(zhàn)鲤拿。但隨著最近推出的全光譜照明裝置和更先進的系統(tǒng)，LED照明正在成為新的標準署咽。

顯微鏡長期以來一直在生物科學研究中占據(jù)重要位置近顷，可追溯到第一次觀察
活細胞包括使用LED的技術已經開發(fā) - 并且將繼續(xù) - 以滿足研究人員新的和不斷變化的需求。

生物科學顯微鏡
生物科學微拷貝中使用的技術可分為兩個主要陣營：

透射光宁否，明視場顯微鏡窒升，用于可視化染色的組織學樣本或采用對比度方法，如相位對比度慕匠，微分干涉對比度和浮雕對比度;
反射光熒光顯微鏡

圖1a饱须，1b。明場顯微鏡圖像描繪了染色載玻片（a）和遷移室（b）中細胞的相襯圖像隔阔。
為了篩選染色組織（圖1a）或對比技術倚衡，如相（圖1b）或DIC，典型的研究實驗室將使用配備12 V白熾鎢鹵燈（100 W）的顯微鏡設置為9 V坐默，色溫約為3200 K.雖然這是一種廉價而有效的設置，但LED光源正成為主要顯微鏡制造商的默認透射光源。LED具有與日光濾光器類似的顯色指數(shù)蚜玲，可提供出色的靈活性并集成到硬件和軟件中浓先。
LED照明已經成為明場顯微鏡的一種選擇，但它在熒光顯微鏡領域卻是如此
已經產生了最大的影響结憾。直到最近十年矢老，高壓汞蒸氣電弧放電燈才是氙氣標準配置工作的替代品。大約在這個時候遗赘，LED成為熒光顯微鏡的一個選擇斋葱。LED克服了很多
與弧光燈相關的問題，包括燈泡的重復更換和隨后的對準疾词，重啟時間溃蛙，啟動后強度的波動以及隨時間的強度下降。
克服汞和氙系統(tǒng)失效的能力并非如此
最初由LED制造商實現(xiàn)绑咱。對于需要單色或雙色系統(tǒng)的研究人員而言绰筛，LED立即適用。然而描融，主流市場需要的是適合標準范圍的熒光團（DAPI铝噩，FITC，TRITC窿克，Cy5）的光源骏庸，以及使用Cy5.5，Cy7年叮，CFP具被，YFP等的靈活性。終端LED系統(tǒng)有四個“固定”通道谋右，確實找到了自己的位置硬猫，但沒有達到預期的效果。
一般光源的作用由金屬鹵化物光源填充改执。鹵化物燈泡持續(xù)了2000小時啸蜜，重要的是它們比四通道LED裝置提供更大的靈活性。鹵化物源也有一些缺點拟国。燈泡在顯微鏡開啟的持續(xù)時間內點亮部竟，而LED僅在短暫的采集期間點亮。一些鹵化物光源的波動系數(shù)可以達到10%排卷。

圖2a庵无，2b。與汞或鹵化物光源相比径肖，基于LED的光源的強度具有更好的壽命和強度穩(wěn)定性（a）娩戳。光譜范圍涵蓋大多數(shù)技術中使用的大多數(shù)熒光團的峰值激發(fā)
鹵化物光源本質上將UV和IR投射到光導上肯锻。由于UV和IR的降解，鹵化物系統(tǒng)中的光導管需要在一段時間后更換更践。但LED對光導的危害較小户犯，消除了任何退化。
為了產生影響藏络，LED制造商需要一種能夠在365到700納米及更長時間內提供光譜照射的系統(tǒng)糜透。通過組合多個波長生產有效的白光源，可直接替代用戶現(xiàn)有的顯微鏡系統(tǒng)和濾光片立方體臭杰。這些還提供了額外的優(yōu)勢
0到100％的強度調整粤咪，隨時間穩(wěn)定的強度（圖2a和2b），即時開/關和集成到軟件中的機會渴杆。
白光LED照明系統(tǒng)應被視為金屬鹵化物和汞的經濟有效替代品寥枝。
如上所述，主要制造商最初為更高級的例程構建了四色LED光源将塑，包括多色脉顿，延時成像。與傳統(tǒng)光源相比点寥，它們具有許多優(yōu)點艾疟，例如強度穩(wěn)定性和速度。
在帶有內部快門的標準延時顯微鏡系統(tǒng)中敢辩，快門將被打開蔽莱，相機曝光被接合，然后每張照片的快門關閉戚长。這仍然會使樣品暴露在來自弧光燈的光下盗冷，使相機獲取時間增加一倍，并可能導致光毒性和實驗失敗同廉。
在實驗中台凰，始終建議從樣本中的多個站點拍攝圖像。這確保了圖像作為整體代表樣本防蚓。在某些情況下橘曙，很難訪問統(tǒng)計所需的點數(shù)
實驗方案中循環(huán)時間內的顯著性。即使在簡單的情況下儒剧，研究人員使用電動顯微鏡并自動更換旋轉木馬中的過濾器惑箕，顏色之間的切換時間可以在500到800毫秒之間，慢快門時間為200毫秒停唐。為克服這一缺陷科谨，一些顯微鏡制造商采用先進的弧光照明系統(tǒng)
快速內部快門（1 ms），以及相鄰位置之間50 ms延遲的快速濾光輪和衰減器时憾。但是渊喘，連續(xù)激活這些組件仍會增加時間開銷并導致圖像捕獲速度變慢诊捆。為了加快成像速度，一些公司采用實時控制器來并行更換組件;這些系統(tǒng)增加的復雜性和成本使它們超出了標準研究實驗室的范圍拨才。最初的四通道LED單元獲得了成功
發(fā)光二極管

平面是幾微米掠恢，使得這樣小的焦平面易受焦點漂移的影響，這通常是由熱膨脹和收縮引起的悠垛。
為了克服熱漂移的挑戰(zhàn)，有兩種常見的方法：基于軟件的算法和基于硬件的z校正娜谊。只要細胞被限制在相似的圖像平面确买，軟件程序就可以充分地保持焦點，但是可以被自由浮動的非粘附細胞混淆纱皆。在硬件漂移校正系統(tǒng)中湾趾，光沿物鏡向后反射到檢測器，實時監(jiān)測并傳遞到顯微鏡Z驅動器中派草。無論細胞環(huán)境如何搀缠，這都將保持所需的焦點位置，并且對于諸如粘著斑形成或新的超分辨率技術（即PALM近迁，STORM和GSD）的許多研究項目而言是至關重要的艺普。

使用LED照明的先進技術
有一系列新興技術傳統(tǒng)上采用激光照射樣品，但現(xiàn)在轉向LED鉴竭。一個例子是結構照明顯微鏡（SIM）歧譬，一種寬視場技術，可以將衍射極限以外的橫向分辨率提高一倍搏存。這是通過將一系列圖案順序投影到樣品上并捕獲圖像测扼，然后進行后處理來實現(xiàn)的。用于產生圖案的快速LED顏色切換和DMD（可變形鏡裝置）意味著與傳統(tǒng)的結構化圖案生成的機械方法相比可以實現(xiàn)高速啡产。
直到最近纲秫，旋轉盤共焦顯微鏡系統(tǒng)的特點是激光器

在這些情況下取得了一些成功
沒有必要將硬件快門，衰減器輪或濾光輪用于配備多波段二向色鏡的顯微鏡肢有。單個LED可以通過TTL觸發(fā)在<1 ms內以所需強度打開单步，從而顯著提高速度。
例如乳侮，當在裝有弧光燈的電動顯微鏡中以50ms的相機曝光時間成像三種顏色時份览，每個位置的時間是
2到3秒，取決于組件的速度诉德。對于配備多波段二向色的LED和顯微鏡晃纹，循環(huán)時間為151 ms。雖然高速系統(tǒng)速度更快柱洽，但LED可以顯著超越它們褂宙。吸收的主要障礙是四線系統(tǒng)的相對不靈活性÷承蓿現(xiàn)在，最新一代LED系統(tǒng)克服了這些問題初家，因為它們配備了多達16個波長（圖3a和3b）偎窘，跨越365nm到770nm，能夠觸發(fā)適合市場上主要四頻濾波器立方體的LED組合溜在。
它們現(xiàn)在已成為普通高速陌知，延時成像以及下面提到的一些先進技術的照明系統(tǒng)。

焦點漂移校正
LED不僅用于在延時顯微鏡中照射樣品掖肋。它們也用于大多數(shù)焦點漂移校正系統(tǒng)（來自制造商等）
如徠卡仆葡，尼康和蔡司），這是用于保持焦點的反饋設備志笼。
在高倍率下沿盅，焦點對準
由于通過系統(tǒng)的光損失而發(fā)光。然而纫溃，現(xiàn)在LED更強大腰涧，它們被用在一些較便宜的系統(tǒng)中。
對于允許更多光傳輸?shù)墓獗P紊浩，LED特別成功窖铡。LED已成為更便宜的替代方案的其他方法是TIRF顯微鏡，光動力療法（其中光用于減少腫瘤）碘云，FRET（福斯特共振能量轉移）用于確定蛋白質 - 蛋白質相互作用和鈣成像谨跌。與最快的基于短弧光柵的系統(tǒng)相比，用于鈣成像的LED已經變得普遍拦腌，因為其亞毫秒開關和更高的穩(wěn)定性吊烫。以前，比例圖像可以10 fps成像岭限。LED的速度增加到100 fps谍钝。

光遺傳學
在神經科學中，長期以來一直希望選擇性地靶向一種細胞類型進行研究而不影響樣品中的其他細胞（圖4）酣器。部分地椭徙，這是在15年前通過使用Cre-Lox方法標記細胞來實現(xiàn)的，所述細胞瞬時表達已知對該細胞類型具有選擇性的基因（圖5）吝重。然而征乳，即使可以標記細胞類型，從單個細胞記錄的方法在技術上具有挑戰(zhàn)性或可能對組織有害沦匿，因此并不總是合適的律姨。
隨著2005年光遺傳學的發(fā)展，克服了其中一些挑戰(zhàn)臼疫。光遺傳學將動作電位的光學調制與選擇性靶標的遺傳方法結合起來择份。
在異質群體中的單細胞類型扣孟，例如在腦組織中。它基于細菌視蛋白的修飾荣赶，細胞視蛋白是單個單元凤价，光活化離子泵，其通過病毒載體選擇性地遞送到靶細胞中拔创。根據(jù)所表達的離子通道利诺，將聚焦光照射到細胞上將選擇性地激活或抑制。
直到過去幾年剩燥，激光仍然被認為是光學刺激立轧，因為它們的光譜線寬窄，組織中的分散度低于非相干光源躏吊。然而，LED的FWHM較窄帐萎，最近功率/光輸出增加（光纖末端100 mW / mm2比伏，近似LED總功率的1％和LED的快速時間切換，“就光遺傳學應用而言辐逝，LED在幾乎所有方面都超過了激光器吸畸，”O(jiān)penOptogenet-ics表示（http://openoptogenetics.org/). 隨著光遺傳學協(xié)議變得更加標準化，并且在新研究實驗室的能力范圍內黄惭，LED光源也是如此對研究組來說越來越有吸引力的選擇翁脓。
LED始終具有需要一個或兩個波長的位置，其中不需要超過四種顏色的靈活性祟俯，或者速度是關鍵因素漫北。然而，隨著最近推出全光譜照明裝置和更先進的系統(tǒng)五妹，具有多達16個波長和快速觸發(fā)市贡，LED照明已成為新的標準。

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