1 信息

細(xì)胞遷移在許多復(fù)雜的生理和病理過程中起著重要作用。傷口愈合測定是研究體外細(xì)胞遷移的簡單方法愈诚。該測定基于以下觀察：在匯合的單層中人工產(chǎn)生的間隙邊緣上的細(xì)胞將遷移直至建立新的細(xì)胞 - 細(xì)胞接觸她按。ibidi Culture-Insert 2 Well為傷口愈合實(shí)驗(yàn)提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需要幾個步驟炕柔。

本應(yīng)用簡報是使用ibidi Culture-Insert 2 Well 在24孔培養(yǎng)板上分析MCF-7細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)方案酌泰。并行測試了五種不同濃度的人表皮生長因子（hEGF）對遷移行為的影響并與對照條件進(jìn)行比較。

2 材料

· 細(xì)胞：MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ: ACC115)

· ibidi實(shí)驗(yàn)耗材:   Culture-Insert 2 Well 24, ibiTreat (ibidi, 80241)

· 細(xì)胞培養(yǎng)表面：ibiTreat

· 細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)

· 細(xì)胞解離溶液：Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)

· 生長因子：human epidermal growth factor (hEGF) (Promokine, C-60170)

· 無菌鑷子

· 倒置顯微鏡触法，最好具有自動圖像采集系統(tǒng)和用于活細(xì)胞成像的頂部培養(yǎng)箱

 3 實(shí)驗(yàn)工作流程

在該實(shí)驗(yàn)中測試了hEGF對MCF-7細(xì)胞遷移行為的影響漂烂。使用五種不同的hEGF濃度，并將遷移行為與未用hEGF處理的對照細(xì)胞進(jìn)行比較展稼。

圖1實(shí)驗(yàn)裝置：測試了五種不同的hEGF濃度（綠色）（5,10,20,30,40ng / ml）束多。未處理的細(xì)胞（白色）作為對照。對每種條件進(jìn)行四次技術(shù)重復(fù)俩堡。

 3.1 步驟1：細(xì)胞接種

正確的接種濃度是一個關(guān)鍵參數(shù)孕赫，因?yàn)?4小時后應(yīng)達(dá)到匯合的單層。需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定所用細(xì)胞系的最佳濃度砌纸。

1. 取下附在μ-Plate底部的保護(hù)膜（圖2A）玉惫。

2. 像往常一樣準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片民议。將MCF-7細(xì)胞懸浮液調(diào)節(jié)至細(xì)胞濃度為5×10 5 細(xì)胞/ ml计灌。

3. 將70μl細(xì)胞懸浮液應(yīng)用于2孔的培養(yǎng)插件每個孔中（圖2B）。避免搖動μ-Plate迂腔，因?yàn)檫@會導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻钟牛。

4. 將細(xì)胞在37°C和5％CO2 培養(yǎng)至少24小時。

圖2在開始細(xì)胞接種步驟（A）之前取下保護(hù)膜膝擂。將70μl細(xì)胞懸浮液填充到2孔培養(yǎng)插件（B）的每個孔中虑啤。

3.1 第2步：劃痕形成

μ-Plate 24 Well的使用并行測試五種不同的hEGF濃度和對照條件。每種實(shí)驗(yàn)條件可以進(jìn)行四次技術(shù)重復(fù)（圖1).

1. 在顯微鏡下觀察培養(yǎng)24小時后的細(xì)胞密度架馋。如果24小時后未達(dá)到融合細(xì)胞單層狞山，則將μ-Plate于細(xì)胞培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)幾個小時全闷。定期檢查匯合點(diǎn)。

2. 將生長因子添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中以獲得以下濃度：0,5,10,20,30和40ng / ml EGF萍启。

3. 用無菌鑷子輕輕取出2孔培養(yǎng)插件总珠。要移除培養(yǎng)插件，請抓住一個角勘纯，如圖3所示局服。

4. 用無細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS洗滌細(xì)胞層以除去細(xì)胞碎片和未附著的細(xì)胞。

5. 小心吸出無細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS驳遵。

6.用移液管將1ml細(xì)胞培養(yǎng)基加到24孔板的每個孔中淫奔。

圖3使用無菌鑷子取出2孔培養(yǎng)插件

3.1 第3步：獲取顯微鏡圖像

我們建議錄制延時視頻，以確定時間依賴性和細(xì)胞遷移的特征堤结。

1. 將μ-Plate 24孔培養(yǎng)板放在顯微鏡上并確定所有24個孔的位置斜擎。

2. 在接下來的幾個小時內(nèi)多次拍攝圖像，開始觀察過程淑免。在24小時內(nèi)每30分鐘拍攝一次圖像即倦。
4 結(jié)果

分析顯微圖像以獲得關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞遷移特征信息。分析細(xì)胞覆蓋區(qū)域隨時間的變化來確定細(xì)胞速度暑礼。

圖4 hEGF對MCF-7細(xì)胞遷移行為影響的比較疚线。測試了四種不同的EGF濃度，并與對照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了比較硅拆。

使用Culture-Insert 2 Well 在24孔培養(yǎng)板上進(jìn)行測試六種不同（或更多）的條件背渤。通過比較細(xì)胞速度與對照條件的速度來分析五種不同hEGF濃度（每種重復(fù)四次）的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示栗衍，與對照組相比熊骆，hEGF增加了MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞速度。如圖4所示丽阎，hEGF> 10ng / ml的濃度顯示細(xì)胞速度沒有進(jìn)一步增加纳倚。