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熒光顯微鏡是目前使用頻率很高的常用實(shí)驗(yàn)室儀器骇扇。如果優(yōu)化從光源到樣品表面的照明是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常碰到的問題唁返。廣州科適特科學(xué)儀器有限公司在給客戶服務(wù)過程中扛聂，根據(jù)客戶反饋和參考相關(guān)文獻(xiàn)累踱，簡要總結(jié)如何優(yōu)化顯微鏡熒光光源保媒。當(dāng)來自顯微鏡熒光光源在通往顯微鏡的樣品表面可能出現(xiàn)問題時(shí)，可以在以下部位查找可能的故障原因惫借。

顯微鏡熒光光源與倒置熒光顯微鏡的連接辟昏。虹色標(biāo)記的位置1-5對(duì)應(yīng)于后續(xù)表格中用于測量的光路中的位置。

近年來堰洛，越來越多的LED光源被用于熒光顯微鏡成像获列。這些LED光源的設(shè)計(jì)克服了汞燈和金屬鹵化物弧光燈的局限性，可提供令人優(yōu)越的性能蛔垢，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了早期的照明光源击孩。LED顯微鏡熒光光源具有高信噪比（SNR）和高分辨率，增強(qiáng)的靈敏度和穩(wěn)定性特點(diǎn)啦桌∷莺可為熒光顯微鏡成像提供高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)具有更長的使用壽命和更低的維護(hù)成本甫男。

但是且改，要實(shí)現(xiàn)LED光源的這些優(yōu)點(diǎn)，必須將照明器的輸出有效的傳送到顯微鏡的樣品表面。我們可以研究一下顯微鏡熒光光源是如何傳遞到顯微鏡樣品表面的又跛。光路分析不僅可以用于優(yōu)化照明效果碍拆，還可以用于解決照明中出現(xiàn)的問題。

顯微鏡光源光路分析

當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)顯微鏡樣品平面的熒光激發(fā)亮度不夠慨蓝，很容易就認(rèn)為光源有問題感混，光強(qiáng)不夠。但通常不一定正確缩髓。因?yàn)閷?shí)際上憨箍，光路的所有中間組件都可能影響最終的樣品表面照明。解決這個(gè)問題需要考慮所有將照明器輸出傳輸?shù)斤@微鏡的光學(xué)組件的情況（請(qǐng)參考下圖）学释，這些配件最終都會(huì)影響整個(gè)顯微鏡的通光率遇娜。

該表對(duì)從顯微鏡熒光光源到顯微鏡樣品表面的光通量進(jìn)行了逐步分析。使用10倍物鏡（位置5A）在樣品平面上測得的光通量大概15–50 mW / mm²粱思，基本在寬場熒光顯微鏡的需求范圍內(nèi)（1–100 mW / mm²）区呕。下圖顯示了用來測試的光源到Nikon Ti顯微鏡樣品表的光通量。

對(duì)于熒光顯微鏡應(yīng)用槐芹，光源提供的輻照度在各波長下是不一樣的海拾。這是因?yàn)闊晒獍l(fā)射光強(qiáng)度取決于可用于熒光團(tuán)吸收的光子數(shù)。對(duì)于相同的輻照度水平填阅，光子數(shù)量隨波長增加眉脖。因此，在其它條件不變的情況下婴鞭，375 nm激發(fā)光下產(chǎn)生一定熒光強(qiáng)度所需的輻照度是750 nm（2×375 nm）所需的輻照度的兩倍柱悬。因此，在顯微鏡光源中通常紅色光譜區(qū)域具有較低的輻射通量水平（635/22 nm未斑；請(qǐng)參閱表的最右列）咕宿。

盡管表中所示的輻射通量水平對(duì)于常規(guī)的寬視野熒光顯微鏡來說是足夠使用的，但確實(shí)存在改進(jìn)的機(jī)會(huì)蜡秽。此類改進(jìn)針對(duì)兩個(gè)主要應(yīng)用需求府阀。首先，要在較短的時(shí)間間隔內(nèi)獲取更多圖像而又不影響信噪比芽突，則需要來自光源的較高輻射度和較短的相機(jī)曝光時(shí)間试浙。第二，許多用于提高寬視野熒光顯微鏡的空間分辨率的技術(shù)會(huì)增加光學(xué)濾片寞蚌。由濾片引起的損耗必須通過增加光源的輸出來補(bǔ)償田巴。

改進(jìn)方法探討

我們參考表中光路，簡要地研究實(shí)現(xiàn)這些改進(jìn)的方法挟秤。

1. 激光光源：與本文舉例使用的LED熒光光源不同壹哺，采用固態(tài)二極管激光光源來提高輸出光功率抄伍。

2. 液體光導(dǎo)管。液體光導(dǎo)可以減少顯微鏡熒光光源引起顯微鏡振動(dòng)管宵。它也可以使光源可以放在遠(yuǎn)離顯微鏡的位置截珍，避免操作空間太擁擠。但是宇涵，液體光導(dǎo)管會(huì)降低顯微鏡熒光光源輸出惰疯，損耗35％到50％的光強(qiáng)⊥黄停可以選擇較大直徑（例如5mm光導(dǎo)管代替3mm）的液體光導(dǎo)管提高輻照度蔫横，這通常需要重新設(shè)計(jì)顯微鏡光路以將增加的光強(qiáng)傳播到樣品平面。

3. 準(zhǔn)直鏡：與基于消色差透鏡的傳統(tǒng)設(shè)計(jì)相比耙窥，采用復(fù)眼透鏡的準(zhǔn)直儀可提供出色的光通量和空間均勻性捞幅。

4. 物鏡：在落射熒光顯微鏡中，熒光強(qiáng)度與物鏡數(shù)值孔徑（NA）相關(guān)还皮，物鏡的數(shù)值孔徑越大，熒光強(qiáng)度也增加雹税。因此效岂，選擇大數(shù)值孔徑的物鏡，同時(shí)具有足夠的工作距離能夠獲得更好的熒光效果旧庶。

總體來說额前，熒光顯微鏡的照明光源技術(shù)不斷在發(fā)展。傳統(tǒng)的弧光燈有很多缺點(diǎn)牵敷，包括它們含有有毒的汞蒸氣胡岔。LED光源由于光強(qiáng)的不斷改進(jìn)，已經(jīng)能夠滿足大部分熒光成像的要求枷餐。但是靶瘸，按照上面介紹的分析步驟進(jìn)行操作，將有助于顯微鏡用戶理解光源與顯微鏡是如何一起工作的毛肋，并有助于找到光源及成像問題的原因怨咪。

參考文獻(xiàn)

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