相機(jī)觸發(fā)LED光源實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞自動(dòng)多色成像方案探討
koster / 2021-06-17
關(guān)鍵詞：熒光顯微鏡蒋令，pE-300Ultra, 序列運(yùn)行，相機(jī)觸發(fā)光源, 多色熒光成像裹刮，PINKEL濾片設(shè)置音榜，活細(xì)胞培養(yǎng)裝置庞瘸。
一.背景介紹
活細(xì)胞多色顯微熒光成像是在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)科研中常用的科研方法≡穑活細(xì)胞培養(yǎng)熒光顯微鏡由于可以進(jìn)行活細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)條件擦囊，例如：溫度控制、濕度控制嘴办、CO
2 濃度控制瞬场、O2 濃度控制，同時(shí)配置高速攝像頭可以進(jìn)行時(shí)間序列（Time-Lapse）涧郊，結(jié)合多色熒光濾片切換贯被，LED 單波長(zhǎng)光源激發(fā)，可配備相差（Phase Contrast）妆艘，微分干涉（DIC）彤灶，熒光等對(duì)照方式可以更加直觀詳細(xì)的進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)記錄而受到廣大科研用戶的認(rèn)可。近年來(lái)批旺，倒置熒光顯微鏡配置活細(xì)胞培養(yǎng)裝置的相關(guān)實(shí)驗(yàn)越來(lái)越普遍寺斟，目前市面上集成的熒光成像系統(tǒng)很多，例如：GE 公司的 DELTAVISION 活細(xì)胞成像系統(tǒng)辽画，ZEISS公司的 CELL OBSERVER 系統(tǒng)，或其它大品牌公司的整套活細(xì)胞成像系統(tǒng)黔琢，價(jià)格通常20
萬(wàn)美元以上阀恳，且維護(hù)成本高，廠家工程師上門速度通常比較慢或者收費(fèi)貴寻癌，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室難以負(fù)擔(dān)薇榨。
活細(xì)胞多色熒光成像主要技術(shù)要求：
1.由于活細(xì)胞時(shí)間序列成像時(shí)間長(zhǎng)，通常要24小時(shí)以上绪封，獲取細(xì)胞形態(tài)的時(shí)間序列圖片進(jìn)行分析魏颠。活細(xì)胞培養(yǎng)箱需要能夠放置在顯微鏡載物臺(tái)上實(shí)時(shí)成像历扭。要求能夠控制精確溫度软苗，濕度，CO2濃度棺氢，O2濃度等細(xì)胞培養(yǎng)條件心爷。
2.活細(xì)胞處于快速運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)行多色熒光成像時(shí)肃续，需要不同熒光通道進(jìn)行快速切換黍檩，傳統(tǒng)的電動(dòng)熒光濾色鏡轉(zhuǎn)盤設(shè)計(jì)的電動(dòng)顯微鏡通常價(jià)格昂貴，設(shè)備復(fù)雜始锚。實(shí)驗(yàn)需要一種更簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)的解決方案刽酱。
3.活細(xì)胞熒光樣品在傳統(tǒng)的熒光光源例如汞燈或者金屬鹵化物光源照射下喳逛，光毒性作用導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，而且在曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)容易照成熒光淬滅棵里。
二．方案介紹
新型的LED
光源由于其使用壽命長(zhǎng)润文，發(fā)熱少，發(fā)射光強(qiáng)恒定且重復(fù)性好衍慎，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)成為越來(lái)越多熒光顯微鏡成像的選擇转唉。隨著LED光源亮度加強(qiáng)和譜線增加，LED光源代替?zhèn)鹘y(tǒng)的汞燈或者金屬氯化物光源已經(jīng)是大勢(shì)所趨稳捆。 LED光源除了使用壽命長(zhǎng)之外,還有一個(gè)最重要的優(yōu)點(diǎn)即控制性好赠法。 LED光源可即時(shí)開(kāi)/
關(guān)，精確的強(qiáng)度控制乔夯。LED光源還可以接受TTL(
晶體管-晶體管邏輯電平)信號(hào)系統(tǒng)控制LED快速波長(zhǎng)切換猴宾，允許通過(guò)多通熒光濾片進(jìn)行高速多色熒光成像，無(wú)震動(dòng)無(wú)濾片偏移醇疮∑崧瘢基于此我們搭建的這套系統(tǒng)如下：
1.通過(guò)LED光源切換配合PINKEL濾片組代替熒光濾片轉(zhuǎn)盤切換通道
2.通過(guò)相機(jī)BNC端口接受TTL信號(hào)觸發(fā)
3.通過(guò)控制面板上的“Sequence Runner”模式設(shè)置LED在接受TTL信號(hào)后運(yùn)行次序。
4.在OCULAR軟件界面設(shè)置相機(jī)曝光觸發(fā)光源巴移，并且設(shè)置曝光時(shí)間您窒。
5.在NIB900倒置熒光顯微鏡上加載鏡載活細(xì)胞培養(yǎng)裝置， 通過(guò)溫度控制器和氣體控制器還調(diào)節(jié)培養(yǎng)罩里面的溫度瞭驴，CO2濃度翻萨，濕度，O2濃度等培養(yǎng)條件退钱。
由于新型LED光源和相關(guān)相機(jī)聯(lián)用俄蔗，多通熒光濾片等技術(shù)的成熟，廣州科適特科學(xué)儀器有限公司作為顯微鏡及顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)裝置欠诊，熒光光源蛀漆，攝像頭等配件的供應(yīng)商。有機(jī)會(huì)搭建并且測(cè)試了一種優(yōu)惠簡(jiǎn)便的解決方案臣疑。
三．測(cè)試過(guò)程
本測(cè)試過(guò)程采用了寧波永新NEXSCOPE NIB900倒置熒光顯微鏡主機(jī)盔憨，配置了CoolLED
公司的pE-300ultra高性能LED光源，通過(guò)100%側(cè)分光口連接Retiga R1相機(jī)讯沈，搭配了德
國(guó)ibidi公司的鏡載活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行活細(xì)胞的培養(yǎng)成像般渡。
主要測(cè)試了以下兩個(gè)方面：
1.通過(guò)Retiga R1相機(jī)通過(guò)外觸發(fā)pE-300Ultra LED光源，在相機(jī)曝光時(shí)同步打開(kāi)LED光源芙盘，并且利用光源當(dāng)中的”Sequence Runner”順序打開(kāi)相應(yīng)的LED熒光通道驯用，顯微鏡濾片采用Chroma公司的多通熒光濾片，進(jìn)行紫外和紅色熒光的快速切換成像。通過(guò)加載活細(xì)胞培養(yǎng)裝置后蝴乔，對(duì)樣品進(jìn)行加熱记餐，進(jìn)行熒光測(cè)試。檢測(cè)成像的均一性和熒光強(qiáng)度對(duì)比薇正。圖像均一性和熒光亮度評(píng)估片酝。
圖1 MitoTracker Red成像(25攝氏度) 圖2 加載活細(xì)胞裝置后MitoTracker Red成像(37攝氏度)
圖3 無(wú)活細(xì)胞裝置DAPI成像(25攝氏度) 圖4 加載活細(xì)胞裝置后DAPI成像(37攝氏度)
2.通過(guò)加載活細(xì)胞培養(yǎng)裝置后，對(duì)樣品進(jìn)行加熱挖腰，進(jìn)行明場(chǎng)測(cè)試雕沿。檢測(cè)成像的均一性和熒光強(qiáng)度對(duì)比。
圖5 無(wú)活細(xì)胞裝置明場(chǎng)病理片成像(25攝氏度) 圖6 加載活細(xì)胞裝置后明場(chǎng)病理片成像(37攝氏度)
圖7 無(wú)活細(xì)胞裝置明場(chǎng)病理片成像(25攝氏度) 圖8 加載活細(xì)胞裝置后明場(chǎng)病理片成像(37攝氏度)
四．分析測(cè)試結(jié)果
1.通過(guò)NIB900直接連接pE-300系列LED光源可以獲得良好的熒光強(qiáng)度和圖像均一性场时。
2.可以通過(guò)相機(jī)曝光觸發(fā)實(shí)現(xiàn)光源同步開(kāi)關(guān)荡西，可以通過(guò)曝光時(shí)間控制光源打開(kāi)時(shí)間，減少樣品過(guò)度曝光導(dǎo)致的熒光淬滅强进。
3.通過(guò)LED光源的內(nèi)置Sequence Runner設(shè)置芯片依次曝光的順序舵翘，實(shí)現(xiàn)TTL觸發(fā)LED光源通道切換代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光濾片轉(zhuǎn)盤切換。提高切換速度袱族，避免震動(dòng)和濾片漂移問(wèn)題服驼。
4.鏡載活細(xì)胞可以精確控制活細(xì)胞培養(yǎng)條件，德國(guó)ibidi活細(xì)胞培養(yǎng)裝置放置在NIB 900顯微鏡上可以精確對(duì)焦渔舵，不影響明場(chǎng)和熒光顯微成像效果鹅唠。能夠搭配同時(shí)使用。
五．測(cè)試配置方案
1倒置熒光顯微鏡主機(jī)：NEXSCOPE NIB900
2.活細(xì)胞培養(yǎng)裝置：ibidi Heating incubator(德國(guó) ibidi)
3.顯微鏡LED光源：CoolLED pE-300Ultra(英國(guó) CoolLED)
4.攝像頭及軟件：Photometrics Retiga R1帶BNC觸發(fā)線, Ocular V2.0.1(加拿大 Photometrics)
5.PINKEL 濾片：Chroma 69401 （美國(guó) Chroma）
6.樣品：invitrogen FLuocells #1 BPAE cells (美國(guó) Invitrogen)
六．總結(jié)
1.搭建的活細(xì)胞培養(yǎng)裝置各部分整合良好劈遂，可以比較經(jīng)濟(jì)的方式實(shí)現(xiàn)順暢的活細(xì)胞多色熒光成像给急。
2.寧波永新NEXSCOPE NIB900具有很高的光學(xué)質(zhì)量，具有DIC度姑，相差，熒光多重功能呈枉，配置了三個(gè)攝像接口（100%/0趁尼；20%/80%;0:100%）。在成像均勻性猖辫，色差還原酥泞，物鏡表現(xiàn)，主機(jī)擴(kuò)展性方面表現(xiàn)良好啃憎，與進(jìn)口顯微鏡同檔次無(wú)明顯差別芝囤，屬少見(jiàn)的國(guó)產(chǎn)研究級(jí)顯微鏡精品。
3.相對(duì)常規(guī)的活細(xì)胞成像系統(tǒng)辛萍，此方案采用新型LED光源悯姊，對(duì)細(xì)胞光毒性較小，適合活細(xì)胞樣品的時(shí)間序列成像贩毕。
4.相機(jī)曝光觸發(fā)光源同步開(kāi)關(guān)悯许，減少非必要的熒光樣品和活細(xì)胞的照射導(dǎo)致的光漂白和光毒性仆嗦。
5.相對(duì)于常規(guī)的活細(xì)胞成像系統(tǒng)，此方案通過(guò)相機(jī)曝光輸出的TTL信號(hào)切換熒光通道先壕。無(wú)需濾片轉(zhuǎn)盤切換瘩扼，減少了顯微鏡震動(dòng)和濾片漂移導(dǎo)致多通道疊加偏差。
6.活細(xì)胞培養(yǎng)裝置中溫度控制是一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)參數(shù)熊赦，但是由于活細(xì)胞培養(yǎng)的探測(cè)器通常位于培養(yǎng)腔室的上壁邊緣农幢，由于室溫（例如 22℃）與培養(yǎng)箱中設(shè)定溫度（例如 37℃）偏差比較大，溫度傳導(dǎo)散熱效應(yīng)疆逸，為了保證真實(shí)培養(yǎng)溫度精確肩容，顯微鏡活細(xì)胞培養(yǎng)在不同的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境首次使用前通常需要進(jìn)行校準(zhǔn)。
7.配件可以單獨(dú)增加或者拆卸慷组，有利于減少實(shí)驗(yàn)預(yù)算肘渔，提高顯微鏡和配件的使用效率。
8.此方法采用相機(jī)觸發(fā)LED光源順序開(kāi)關(guān)LED通道溢棱，配合多通熒光濾片可以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)的系統(tǒng)活細(xì)胞多色熒光成像功能繁莲。并且可以獲得更好的時(shí)間方便率。切換速度更快吩伊，適合活細(xì)胞樣品多重?zé)晒獬上瘛?/span>
9.由于缺乏活細(xì)胞樣品拢胆，有些功能比如活細(xì)胞時(shí)間序列，微分干涉觀察便螟，相差成像等此次沒(méi)有完成測(cè)試猛计，等有條件后續(xù)進(jìn)行。
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