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介紹

Axygen 凝膠成像系統(tǒng)-BL（產(chǎn)品貨號(hào)：GDBL-1000）是一種易于使用的凝膠圖像捕獲系統(tǒng)咙驾，可使用 302 nm 波長(zhǎng)紫外光 (UV 302) 生成高質(zhì)量的16位TIFF圖像)外卷、365 nm 波長(zhǎng)紫外光 (UV 365)砍的、470 nm 藍(lán)光或 Epi 白光。藍(lán)色光源可以使用溴化乙錠替代染料莺治，避免紫外線照射和溴化乙錠的潛在致突變效應(yīng)廓鞠。

在這里，我們?cè)?span>Axygen凝膠成像系統(tǒng)-BL中使用藍(lán)光與溴化乙錠替代染色劑SYBR?Safe和GelGreen?進(jìn)行了一項(xiàng)限制檢測(cè)研究谣旁，并使用UV 302與溴化乙錠進(jìn)行了對(duì)比床佳。對(duì)每個(gè)凝膠染色和光照組合的兩個(gè)DNA片段(~6107 bp和~1746 bp)的連續(xù)稀釋度進(jìn)行評(píng)估，并使用凝膠分析軟件從凝膠圖像中測(cè)定最低濃度為1D榄审。將SYBR?Safe和GelGreen?染色劑與藍(lán)光結(jié)合使用砌们，得到的DNA檢測(cè)限度與使用溴化乙啶染色劑和紫外光302光照暴露的限度相當(dāng)，證明了該儀器的多用途性搁进。此外怨绣，還比較了藍(lán)光和紫外光302照射下DNA的轉(zhuǎn)化效率。

材料/方法

DNA 樣品制備

質(zhì)粒 DNA pCMV-SPORT-Bgal（Thermo Fisher Cat. No. 10586-014）在HindIII(693)和ScaI(6800) 位點(diǎn)使用限制性內(nèi)切酶拷获，雙重消化進(jìn)行切割以產(chǎn)生兩個(gè)片段，長(zhǎng)度約為 6107bp和1746bp减细。簡(jiǎn)而言之匆瓜，將酶 HindIII-HF?（New England Biolabs (NEB) Cat. No. R3104）和 ScaI-HF?（NEB Cat. No. R3122）與質(zhì)粒 DNA 以1.0μL酶/1.0μg DNA 的比例混合10X CutSmart? 緩沖液（NEB 目錄號(hào) B7204 S），用康寧分子生物學(xué)級(jí)水（康寧貨號(hào)：46-000-CM）稀釋十倍顷床。雙酶切在 37℃下孵育20分鐘跪悼，然后通過(guò)在 80℃下加熱滅活 20 分鐘。消化后的DNA儲(chǔ)存在-20℃脸榔。

凝膠電泳

通過(guò)將 2.25g瓊脂糖 LE（康寧貨號(hào)：AGR-LE-100）熔化在 225 mL 1X TBE 緩沖液中來(lái)制備瓊脂糖凝膠（1%）蚊来，該緩沖液是通過(guò)稀釋 10X TBE 緩沖液（康寧貨號(hào)：AGR-LE-100）制備的。46-011-CM) 十倍于康寧分子生物學(xué)級(jí)水中汗歧。就在將凝膠倒入帶有兩個(gè) 20 孔梳子的 15 x 15 cm 托盤(pán)之前逢君，添加凝膠染料并使用 11.25 μL 溴化乙錠（Sigma-Aldrich 目錄號(hào) E1510-10ML）、22.5 μL SYBR Safe DNA 混合凝膠染色劑（Thermo Fisher Cat. No. S33102）惶嗓，或 22.5 μL GelGreen 核酸凝膠染料（Biotium 目錄號(hào) 41005）蒲妹。將固化的凝膠轉(zhuǎn)移到 Axygen? 水平凝膠盒（康寧目錄號(hào) HGB-15）的主罐中，用 1X TBE 緩沖液填充至最大填充線尸粒。將 Axygen 1 Kb DNA 階梯（康寧目錄號(hào) M-DNA-1kb）添加到兩排泳道 1块透、20、21 和 40 的孔事矾，6 μL/孔巍碍。對(duì)于 18 個(gè)樣品，消化的 DNA 以 1:2 進(jìn)行系列稀釋甥材，與 6X DNA 凝膠加載染料（Thermo Fisher Cat. No. R0611）混合盯另，并加載到12 μL/孔進(jìn)入泳道 2 至 19 和 22 至 39性含，加載的 DNA 總量從泳道 2 和 22 中的 200.00 ng 到泳道 19 和 39 中的 1.50 pg。凝膠在 110 伏恒定電壓下運(yùn)行 80 分鐘.對(duì)于每個(gè)凝膠染色土铺，DNA 樣品獨(dú)立運(yùn)行兩次胶滋，每個(gè)凝膠染色的每個(gè) DNA 數(shù)量總共有四個(gè)泳道。

凝膠成像和分析

凝膠電泳后悲敷，立即使用 Axygen Gel Documentation System-BL 對(duì)每個(gè)凝膠進(jìn)行成像究恤。對(duì)于溴化乙錠染色的凝膠，使用 UV 302 光照射凝膠后德。對(duì)于用 SYBR Safe 和 GelGreen 染色的凝膠部宿，使用藍(lán)光照射凝膠。對(duì)于所有凝膠圖像瓢湃，使用泳道 1 和 21 中的梯子根據(jù)感興趣區(qū)域 (ROI) 自動(dòng)選擇曝光時(shí)間理张。使用 TotalLab 1D 凝膠分析軟件（14.0 版）分析凝膠圖像，以及 DNA 片段大小和濃度是根據(jù)使用 1 Kb DNA 梯的校準(zhǔn)確定的绵患“喂荩可以檢測(cè)到具有可量化 DNA 量 (> 0.00 ng) 的最低樣品的 DNA 量被確定為每個(gè)凝膠染色的檢測(cè)限。

轉(zhuǎn)換效率

通過(guò)轉(zhuǎn)化效率研究確定了 UV 302 和藍(lán)光照射對(duì) DNA 質(zhì)量的影響图瘾。質(zhì)粒 DNA pCMV-SPORT-Bgal 在分子生物學(xué)級(jí)水中稀釋至 2.5 ng/μL勇剃，并在 1.7 mL 微量離心管（康寧目錄號(hào) 3207）中分裝到 10 μL 體積中。

對(duì)于每項(xiàng)研究赏晃，每個(gè)管都在 Axygen 凝膠成像系統(tǒng)-BL 中暴露于藍(lán)光或 UV 302 光下 1好佃、2、4施司、7 或 10 分鐘毫胎。未暴露于藍(lán)光或 UV 302 光的儲(chǔ)備 DNA 用作陽(yáng)性對(duì)照。 MAX Efficiency? DH5α? 感受態(tài)細(xì)胞（Thermo Fisher Cat. No. 18258-012）用 DNA 樣品轉(zhuǎn)化衍周。簡(jiǎn)而言之茄焊，將細(xì)胞在冰上解凍，并在每個(gè)冷卻的 17 x 100 毫米聚丙烯管中用 1 微升 DNA 等分100 微升尚染。細(xì)胞在冰上孵育30分鐘律逼，42°C熱激45秒，放冰2分鐘逗柴。細(xì)胞用 0.9 mL S.O.C.按 1:10 稀釋蛹头。培養(yǎng)基（康寧目錄號(hào) 46-003-CR）并在 37°C 下以 225 rpm 搖動(dòng)孵育 1 小時(shí)。使用 1:100 稀釋培養(yǎng)物S.O.C.培養(yǎng)基戏溺，將 100 μL 稀釋液涂抹在含有 100 μg/mL 氨芐青霉素渣蜗、60 μg/mL X-gal 和 0.1 mM IPTG（Teknova 目錄號(hào) L1902）的 LB 瓊脂平板上，用于過(guò)夜培養(yǎng)。計(jì)算菌落形成單位 (CFU) 的數(shù)量以確定轉(zhuǎn)化效率耕拷。

結(jié)果/討論

凝膠電泳后讼昆，立即使用 Axygen? Gel Documentation System-BL 對(duì)每塊凝膠進(jìn)行成像。用溴化乙錠染色的凝膠用 UV 302 光照射骚烧，而用 SYBR? Safe 和 GelGreen 染色的凝膠用藍(lán)光照射浸赫。從代表性 SYBR Safe 凝膠圖像中可以看出，泳道 1赃绊、20既峡、21 和 40 包含具有大小介于 300 至 10,000 bp 之間的 DNA 條帶的 Kb DNA 階梯（圖 1）。在泳道 2 和 22 中可以觀察到最粗和最亮的條帶碧查，代表大約 ~6107 bp 和 ~1746 bp DNA 片段运敢，其中接收了 200.00 ng 的總 DNA。隨著 DNA 量在凝膠上從左到右稀釋舅尸，樣品 DNA 條帶的厚度和亮度也降低斯身。

通過(guò)使用 TotalLab 1D 凝膠分析軟件并將樣品 DNA 條帶校準(zhǔn)到已知的 DNA 條帶大小和加載到 1 Kb 階梯中的數(shù)量，計(jì)算出每個(gè)泳道中檢測(cè)到的 DNA 量得鸳。無(wú)論凝膠染色或光源如何遍考，在每個(gè)泳道中檢測(cè)到的 DNA 量在整個(gè)凝膠中都減少，與加載的 DNA 量直接相關(guān)（圖 2）扳引。根據(jù)對(duì) 1 Kb DNA 階梯的校準(zhǔn)铣滥，確定并計(jì)算出可檢測(cè)和計(jì)算的最低 DNA 量，并使用核酸凝膠染色劑和光源類型的每種組合進(jìn)行比較照窥。檢測(cè)限列于表 1 中，作為從 4 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的最低 DNA 量范圍涎瓜。使用帶有 UV 302 光的溴化乙錠羹李，較大的 DNA 片段 (~6107 bp) 的檢測(cè)限低至 6.25 ng，而較小的 DNA 片段 (~1746) 的檢測(cè)限低至 50.00 ng慈宾。使用藍(lán)光 SYBR Safe DNA 凝膠染色劑產(chǎn)生的檢測(cè)限與兩種 DNA 片段的溴化乙錠/UV 302 檢測(cè)限相當(dāng)猖驹。然而，使用帶有藍(lán)光的 GelGreen 核酸凝膠染色劑導(dǎo)致檢測(cè)限低至 3.13 ng~6107 bp 片段和 ~1746 bp 片段的 12.5 ng酗宋。對(duì)于 GelGreen 核酸凝膠染料积仗，與溴化乙錠或 SYBR 安全檢測(cè)限相比，4 項(xiàng)獨(dú)立研究的檢測(cè)限變化范圍更大蜕猫。當(dāng)納入檢測(cè)限范圍時(shí)寂曹，使用帶有藍(lán)光的 SYBR Safe 或 GelGreen 染料證明

檢測(cè)限至少與使用溴化乙錠和 UV 302 光相當(dāng)。UV 302 光和藍(lán)光照射對(duì) DNA 質(zhì)量的影響是通過(guò)對(duì) MAX Efficiency DH5α 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化效率研究來(lái)評(píng)估的回右，這些細(xì)胞的 DNA 已經(jīng)暴露于 UV 302 或藍(lán)光下 1 到 10 分鐘隆圆。暴露于 UV 302 的 DNA 顯示UV 302 暴露 2 分鐘后轉(zhuǎn)化效率為陽(yáng)性對(duì)照（無(wú)光暴露）的一半，UV 302 暴露 10 分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化效率為 0（即未形成菌落）（圖 3）翔烁。然而渺氧，暴露于藍(lán)光下的 DNA 并未表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化效率隨時(shí)間的下降旨涝，在藍(lán)光暴露 10 分鐘的過(guò)程中保持與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)?shù)?span> CFU 水平。

結(jié)論

1. Axygen? 凝膠文檔系統(tǒng)-BL 與常用的核酸凝膠染料兼容侣背，包括溴化乙錠白华、SYBR? Safe 和 GelGreen?。

2.使用 Axygen 凝膠文檔系統(tǒng)-BL 的各種功能贩耐，每種凝膠染色的兩種不同 DNA 條帶大小都觀察到了可比的低檢測(cè)限弧腥。

3. Axygen 凝膠文檔系統(tǒng)-BL 具有藍(lán)光功能，可與溴化乙錠替代染料一起使用酿萄，從而在檢測(cè)限研究中具有相當(dāng)?shù)撵`敏度序机。

4.Axygen Gel Documentation System-BL 的藍(lán)光特性不會(huì)對(duì) DNA 的質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響，這是通過(guò)將 DNA 直接暴露在光線下長(zhǎng)達(dá) 10 分鐘后的轉(zhuǎn)化效率來(lái)衡量的争峭。

表 1. 檢測(cè)到的最低 DNA 量范圍 (ng)

每次測(cè)量使用 N = 4 個(gè)波段寥只。 EtBr = 溴化乙錠； UV 302 = 302 nm 波長(zhǎng)的紫外光馍逗； BL = 藍(lán)光冻找。

圖1.代表性凝膠圖像。使用 1X SYBR Safe 核酸染色劑澆鑄 1% 瓊脂糖凝膠衩羹。將被切割成兩個(gè)片段（6107 bp 1746 bp）的質(zhì)粒 DNA pCMVSPORT-Bgal 的 1:1 稀釋系列添加到泳道2至19和 22 至 39 中帜蘑，泳道中的量最高（200.00 ng）2 和 22 以及泳道 19 和 39 中的最低數(shù)量 (1.50 pg)。將 1 Kb 梯形 DNA 標(biāo)記物 (6 μL) 添加到泳道 1弧劳、20珍垦、21 和 40。電泳后壁挖，使用 Axygen 凝膠文檔系統(tǒng)-BL 用藍(lán)光照射瓊脂糖凝膠以進(jìn)行圖像捕獲图呢。

圖 2. DNA 定量檢測(cè)限。檢測(cè)到的總 DNA 量（根據(jù)將樣品校準(zhǔn)到 Axygen 1 Kb DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)而確定）在整個(gè)凝膠中減少骗随，與加載的 DNA 量減少直接相關(guān)蛤织。顯示了來(lái)自用藍(lán)光照射的 SYBR Safe 染色凝膠的代表性數(shù)據(jù)。條帶 1 ~6107 bp鸿染，條帶 2 ~1746 bp指蚜。

圖 3. DNA 暴露在光下的轉(zhuǎn)化效率。將 DNA 等分試樣直接暴露于 UV 302 或藍(lán)光下長(zhǎng)達(dá) 10 分鐘涨椒。暴露的 DNA 的轉(zhuǎn)化效率是通過(guò)使用 MAX Efficiency DH5α 感受態(tài)細(xì)胞確定的摊鸡，該細(xì)胞使用光照后的 DNA。暴露于 UV 302 的 DNA 的轉(zhuǎn)化效率在暴露 10 分鐘的過(guò)程中顯著降低至 0蚕冬，而與陽(yáng)性對(duì)照（無(wú)光暴露）相比柱宦，暴露于藍(lán)光的 DNA 的轉(zhuǎn)化效率沒(méi)有顯著變化。 N = 3 項(xiàng)獨(dú)立研究。黑線 = 無(wú)光陽(yáng)性對(duì)照的平均值掸刊。