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類器官、細(xì)胞球與3D細(xì)胞培養(yǎng)在疾病模型與再生醫(yī)學(xué)研究中展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力鳖灰。然而须涕，手動統(tǒng)計仍然是大多數(shù)實驗室進行3D細(xì)胞研究時所采用的常規(guī)手段征离，這種方法不僅耗費大量時間與人力，在統(tǒng)計3D結(jié)構(gòu)尺寸時也容易受到人為因素干擾而造成誤差肚让。本期的小C講堂引继，將為大家?guī)鞢orning細(xì)胞計數(shù)儀(Corning Cat. No. 6749)與類器官計數(shù)軟件(Corning Cat. No. 6749-OC)自動化計數(shù)解決方案，可以快速精準(zhǔn)地獲取3D細(xì)胞球的數(shù)量與尺寸數(shù)據(jù)级嘀。

細(xì)胞球的建立

MRC5細(xì)胞在康寧 Elplasia? 球面底6孔板（Corning Cat. No. 4440）中培養(yǎng)成球广莉。培養(yǎng)板底部有多個超低吸附表面的微腔，支持每孔形成多達2885個尺寸一致的細(xì)胞球胖讶。在本研究中我們設(shè)置了3組細(xì)胞濃度德检，使每個微腔中MRC5細(xì)胞的起始平均分布各有50、100和200個（每孔起始細(xì)胞數(shù)分別為1.44 x 106斯娃、2.89 x 106或 5.77 x 106個）用于形成不同尺寸（定義為小澎灸、中和大）的細(xì)胞球。如圖1所示蛔垢，細(xì)胞接種后在37°C 和 5% CO2 條件下培養(yǎng)2天击孩，即可在微腔中形成細(xì)胞球。

圖1. 經(jīng)過兩天的培養(yǎng)后鹏漆，康寧 Elplasia? 板中形成的尺寸一致的細(xì)胞球

細(xì)胞球計數(shù)

細(xì)胞球懸液制備：將兩個孔中獲得的細(xì)胞球（約5000個）轉(zhuǎn)入15 mL 離心管中巩梢，以 200 x g 離心 3 分鐘，棄掉上清并用 100 μL 的 PBS重懸艺玲。

Corning細(xì)胞計數(shù)儀（Corning Cat. No. 6749）與類器官計數(shù)軟件（Corning Cat. No. 6749-OC）一起用于自動計算球體的濃度和大小括蝠。將20 μL 細(xì)胞球懸液加入到3D counting chamber (Corning Cat. No. 480201)中，置于載物臺上進行分析饭聚。3D counting chamber深度為0.2 mm忌警，適配直徑20– 200 μm的細(xì)胞球體結(jié)構(gòu)∶胧幔康寧自動化解決方案為用戶提供了兩種基于圖像算法的操作選項法绵，以分別應(yīng)對不規(guī)則的3D結(jié)構(gòu)和規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，此處示例為球形結(jié)構(gòu)圖像計算方案酪碘。

手動統(tǒng)計是將 10 μL細(xì)胞球懸液加入 384 孔高內(nèi)涵成像微孔板（Corning Cat. No. 4681）中熏萎，在顯微鏡下仔細(xì)觀察、計數(shù)解夜，并計算細(xì)胞球濃度吃会。

實驗結(jié)果

Corning細(xì)胞計數(shù)儀的圖像分析算法能夠準(zhǔn)確識別不同尺寸的細(xì)胞球（圖2）。

圖2. 使用Corning細(xì)胞計數(shù)儀自動計數(shù)與手動計數(shù)的典型圖李狼。（A-C）每個微腔50個細(xì)胞形成的細(xì)胞球炊办；（D-F）每個微腔100個細(xì)胞形成的細(xì)胞球；（G-I）每個微腔200個細(xì)胞形成的細(xì)胞球；（A, D, G）計數(shù)前細(xì)胞球的明場圖像何哎；（B, E, H）使用圖像分析算法分析細(xì)胞球的明場圖像稽舱；（C, F, I）顯微鏡下 384 孔微孔板中細(xì)胞球的明場圖像

相較于手動計數(shù)法，Corning細(xì)胞計數(shù)儀計算得出的細(xì)胞球濃度更加接近于理論值（圖3）拳笨，而兩種方法測量出的細(xì)胞球的直徑?jīng)]有顯著差異（圖4）眉脖。

圖3. 細(xì)胞球濃度統(tǒng)計結(jié)果

圖4. 細(xì)胞球直徑統(tǒng)計結(jié)果

結(jié)論

Corning細(xì)胞計數(shù)儀類器官計數(shù)軟件可以快速且精準(zhǔn)地統(tǒng)計類器官或細(xì)胞球等3D結(jié)構(gòu)的數(shù)量與尺寸，可以完美代替?zhèn)鹘y(tǒng)的手工計數(shù)方法茶壹，既省時省力头趴，又節(jié)約實驗耗材。

Corning細(xì)胞計數(shù)儀類器官計數(shù)軟件所提供的圖像分析方法咆蒿，能在應(yīng)用范圍內(nèi)準(zhǔn)確識別出不同尺寸的不規(guī)則類器官或規(guī)則的細(xì)胞球东抹，從而為使用者直接提供類器官的數(shù)據(jù)。